Леонид Александрович Шапошников, Святослав Сергеевич Савин, Денис Леонидович Атрошенко, Татьяна Анатольевна Чубарь, Евгений Владимирович Пометун, Владимир Иванович Тишков, Анастасия Александровна Пометун
Инженерия N-концевой
последовательности формиатдегидрогеназы из сои GlycineMax
Реферат
Аннотация.NAD(P)+-зависимая
формиатдегидрогеназа (FDH, КФ 1.2.1.2.) катализирует окисление формиат-иона при сопряженном
восстановлении NAD(P)+ до NAD(P)H. Ранее в нашей лаборатории была получена генетическая конструкция с
геном soyfdh2, кодирующим изофермент 2
формиатдегидрогеназы из сои Glycinemax (SoyFDH), в котором была удалена нуклеотидная последовательность, кодирующая
сигнальный пептид, отвечающий за транспорт профермента в митохондрии клеток
растений (фермент SoyFDH_L). В настоящей работе получен второй
вариант SoyFDH_S, в котором по сравнению с SoyFDH_L последовательность на N-конце была уменьшена и изменена в целях получения
начального участка, соответствующего последовательности N-конца в FDH из бактерий Pseudomonassp.101. Далее на N-конец этой и укороченной форм SoyFDH была добавлена последовательность
из шести остатков гистидина (His-tag). Все четыре варианта SoyFDH были экспрессированы в клетках E. coliBL21(DE3)CodonPlus, проведена очистка этих
ферментов, определены их кинетические параметры и исследована
термостабильность. Показано, что в случае SoyFDH_L, аналогичной природному варианту фермента, как с His-tag, так и без него уровень экспрессии выше в два раза
по сравнению с укороченным вариантом. Добавление His-tag на N-конец ферментов снижает уровень
экспрессии. Изменение последовательности N-конца, а также введение на N-конец последовательности His-tag не оказывает значительного влияния на
термостабильность при температуре 50–56 °С, однако за счет более высоких
значений энтальпии активации процесса термоинактивации укороченная форма при
нормальных значениях температуры стабильнее природной в 3 раза. Сравнение
кинетических параметров двух вариантов SoyFDH показывает, что каталитические
константы одинаковы, но длинный вариант SoyFDH_L имеет более низкие значения KMHCOO–, а короткий – более низкие
значения KMNAD+. Введение His-tag на N-конец
ферментов не оказывает влияния на их кинетические параметры.
Ключевые слова: формиатдегидрогеназа, Glycinemax, белковая инженерия,
каталитические параметры, температурная стабильность
DOI:
10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-3-377-390
Полный текст статьи в формате PDF
Вестник Московского Университета.
Химия 2023, том 64, № 4, стр. 377-390
Copyright (C) Химический факультет МГУ, 2023
|