А.Ю. Христиченко, А.А. Полозников, Д.М. Хушпульян, Н.А. Смирнова, А.А. Захарянц, С.В. Казаков, В.И. Тишков, И.Г. Газарян
Количественный анализ действия клеточных репортеров на
основе фьюжен-белков люциферазы
Реферат
Клеточные репортеры на основе экспрессии слитых белков
люциферазы с доменами траскрипционных факторов, ответственных за их
стабильность, представляют собой микробиореакторы, позволяющие напрямую следить
за судьбой транскрипционного фактора (или его домена), меченного люциферазой, в
реальном времени. Для понимания принципиальных возможностей и ограничений
данных систем при использовании в прикладных и фундаментальных исследованиях
необходима разработка количественного описания их действия, которая
предполагает расчет/измерение действующей внутриклеточной концентрации слитых
белков и скорость их наработки. В данной работе на основе экспериментальных
данных рассчитана внутриклеточная концентрация фьюжен-белков люциферазы в
стационарном состоянии в линиях нейробластомы SH-SY5Y, стабильно экспрессирующих
слитые белки-репортеры HIF1 ODD-luc и Neh2-luc,
методом калибрования по люциферазной активности. Показано, что в обоих случаях
концентрация слитых белков люциферазы составляет порядка 60–80 нМ, что
близко к значениям как константы Михаэлиса (10–100 нМ HIF)
для HIF пролил гидроксилазы, так и константы
диссоциации комплекса Keap1–Nrf2
(50 нМ) (параметров, контролирующих скорость-лимитирующие стадии действия репортеров
HIF1 ODD-luc
и Neh2-luc соответственно).
Новые данные дают возможность оценить скорость наработки и максимально
достижимую концентрацию фьюжен-белков в условиях их стабилизации. Это позволяет
предложить количественную схему действия репортера Neh2-luc для объяснения значительного сдвига кажущихся параметров
активации по сравнению с истинными константами диссоциации, определяемыми для
известных активаторов "вытеснения" в гомогенном анализе методом поляризации
флуоресценции с использованием рекомбинантного Keap1 и
меченого Nrf2 пептида.
Ключевые слова: Nrf2, Keap1, HIF пролилгидроксилаза,
бардоксолон, андрографолид, активаторы вытеснения.
Полный текст статьи в формате PDF
Вестник Московского Университета.
Химия 2019, том 60, № 4, стр. 240-247
Copyright (C) Химический факультет МГУ, 2019
|