Д.Л. Атрошенко, И.В. Голубев, С.С. Савин, В.И. Тишков

Влияние заменыостатков Met на остаток Leu на каталитические свойства, окислительную и температурную стабильности оксидазы D-аминокислот дрожжей

Окислительная стабильность ферментов определяется в первую очередь остатками Cys и Met. В случае оксидазы D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO) методом направленного мутагенеза получены три мутеина с точечными заменами остатка Met на остаток Leu. Выбор положений для введения замены сделан на основе множественного выравнивания аминокислотных последовательностей DAAO из разных источников, а также анализа трехмерной структуры TvDAAO. Для полученных мутантов изучены каталитические свойства, а также температурная и окислительная стабильность. Во всех случаях замена привела к изменению у мутантных ферментов профиля субстратной специфичности. Наблюдается заметное увеличение констант Михаэлиса для небольших субстратов и уменьшению К_М для D-аминокислот с объемным боковым радикалом. Показано, что в результате одной из замен происходит повышение температурной стабильности TvDAAO в 2–3 раза по сравнению с ферментом дикого типа. Разработана методика определения стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода. Изучена окислительная стабильность фермента дикого типа и полученных мутантных TvDAAO. Установлено, что во всех случаях замена остатка Met на остаток Leu незначительно повлияла на окислительную стабильность фермента.
Ключевые слова: оксидаза D-аминокилот, Trigonopsis variabilis, направленный мутагенез, окислительная стабильность, каталитические свойства, температурная стабильность.

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2016, том 57, № 4, стр. 253-263