Учебные материалы по физической химии
Задачи по физической химии.Часть 2.Химическая кинетика. Электрохимия

Во многих случаях скорость реакции резко изменяется в присутствии специальных веществ - катализаторов. Катализаторы участвуют в реакции, но в результате ее не расходуются. Катализаторы биологических процессов, протекающих в живых организмах, представляют собой белковые молекулы, которые называют ферментами, или энзимами.

Простейшая схема ферментативного катализа включает обратимое образование промежуточного комплекса фермента (E) с реагирующим веществом (субстратом, S) и разрушение этого комплекса с образованием продуктов реакции (P):

Применение квазиравновесного приближения к этой схеме (при условии k₂ << k_-1) с учетом уравнения материального баланса [E] = [E]₀ - [ES] (индекс "0" обозначает начальную концентрацию) позволяет выразить скорость образования продукта через начальную концентрацию фермента и текущую концентрацию субстрата:

,

где K_S = k_-1 / k₁ = [E]. [S] / [ES] - субстратная константа. При увеличении концентрации субстрата скорость реакции стремится к предельному значению: w_max = k_2. [E]₀. Скорость реакции связана с максимальной скоростью соотношением:

. (7.1)

Обычно в эксперименте измеряют зависимость начальной скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата: w₀ = f([S]₀). Проведение таких измерений для ряда начальных концентраций позволяет определить параметры уравнения (7.1) - K_S и w_max.

Чаще всего для анализа кинетических схем ферментативного катализа используют метод стационарных концентраций (k₂ >> k₁). Применение этого метода к простейшей схеме катализа дает уравнение Михаэлиса-Ментен:

, (7.2)

где w_max = k₂^. [E]₀ - максимальная скорость реакции (при бесконечно большой концентрации субстрата),

- константа Михаэлиса. Эта константа равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной скорости. Типичные значения K_M - от 10^-6 до 10^-1 моль/л. Константу скорости k₂ иногда называют числом оборотов фермента. Она может изменяться в пределах от 10 до 10⁸ мин^-1.

Уравнение (7.2) можно записать в других координатах, более удобных для обработки экспериментальных данных:

(7.2а)

(координаты Лайнуивера-Берка) или

. (7.2б)

Для определения параметров K_M и w_max по уравнениям (7.2а) и (7.2б) проводят серию измерений начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата и представляют экспериментальные данные в координатах 1/w₀ ё 1/[S]₀ или w₀ ё w₀/[S]₀.

Иногда течение ферментативной реакции осложняется присутствием ингибиторов - веществ, способных образовывать комплексы с ферментом или фермент-субстратным комплексом. Различают конкурентное, неконкурентное и смешанное ингибирование.

При конкурентном механизме ингибитор (I) конкурирует с субстратом за активные участки фермента. Простейшая кинетическая схема данного процесса имеет вид:

Применение квазистационарного приближения к комплексу ES и квазиравновесного приближения к комплексу EI с учетом уравнений материального баланса [E] + [ES] + [EI] = [E]₀ и [I] " [I]₀ дает для скорости реакции уравнение типа (7.2):

, (7.3)

где эффективная константа Михаэлиса связана с исходной концентрацией ингибитора:

; (7.3а)

Величину K_I = [E]. [I] / [EI], которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором, называют константой ингибирования. Таким образом, при конкурентном ингибировании увеличивается константа Михаэлиса, а максимальная скорость ферментативной реакции остается неизменной.

При неконкурентном механизме ингибитор обратимо связывает промежуточный комплекс фермента с субстратом. Простейшая кинетическая схема данного процесса имеет вид:

,

где предполагается, что константы диссоциации комплексов EI и ESI одинаковы: [E]. [I] / [EI] = [ES]. [I] / [ESI] = K_I. Применение квазистационарного приближения к комплексу ES и квазиравновесного приближения к комплексам EI и ESI с учетом уравнений материального баланса [E] + [ES] + [EI] + [ESI] = [E]₀ и [I] " [I]₀ дает для скорости реакции уравнение типа (7.2):

, (7.4)

где эффективная максимальная скорость связана с начальной концентрацией ингибитора выражением:

. (7.4а)

При неконкурентном ингибировании максимальная скорость реакции уменьшается, а константа Михаэлиса остается неизменной.

Смешанное ингибирование описывается более сложными кинетическими схемами. При смешанном ингибировании изменяются и константа Михаэлиса, и максимальная скорость ферментативной реакции.

ПРИМЕРЫ

Пример 7-1. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость гидролиза аденозинтрифосфата, катализируемого миозином, по следующим кинетическим данным:

Решение. Уравнение Михаэлиса-Ментен в данных координатах имеет вид (7.2б), следовательно, точки пересечения с осями имеют координаты: (0;w_max) для оси ординат, (w_max/K_M;0) для оси абсцисс. Первая точка пересечения дает значение w_max = 2.1^. 10^-6 моль/(л. с). Вторая точка позволяет найти константу Михаэлиса: w_max/K_M = 14.6^.10^-3 с^-1, K_M = 2.1^. 10^-6 / 14.6^.10^-3 = 1.44^.10^-4 моль/л.

Пример 7-2. Ферментативная реакция (K_M = 2.7^.10^-3 моль/л) подавляется конкурентным ингибитором (K_I = 3.1^.10^-5 моль/л). Концентрация субстрата равна 3.6^. 10^-4 моль/л. Сколько ингибитора понадобится для подавления реакции на 65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы уменьшить степень подавления до 25%?

Решение. 1) Конкурентное ингибирование описывается формулами (7.3) и (7.3а). 65%-ное подавление реакции означает, что скорость ингибируемой реакции составляет 35% от скорости реакции в отсутствие ингибитора:

,

откуда следует, что

.

В этой формуле известны значения K_M, K_I и [S]. Концентрация ингибитора равна:

6.5^. 10^-5 моль/л.

Уменьшение степени ингибирования до 25% означает, что скорость ингибируемой реакции составляет 75% от нормальной:

,

где в данном случае известны K_M, K_I и [I]₀. Отсюда можно выразить искомую концентрацию субстрата:

1.4^.10^-2 моль/л.

Таким образом, для уменьшения степени ингибирования до 25% концентрацию субстрата надо увеличить в 1.4^. 10^-2 / 3.6^.10^-4 = 40 раз.

ЗАДАЧИ

7-1. Гидролиз ацетилхолина катализируется ферментом ацетилхолинэстеразой, число оборотов которой составляет 25000 с^-1. Сколько времени потребуется ферменту для расщепления одной молекулы ацетилхолина? (ответ)

7-2. Для некоторой ферментативной реакции константа Михаэлиса равна 0.035 моль/л. Скорость реакции при концентрации субстрата 0.110 моль/л равна 1.15^.10^-3 моль/(л. с). Найдите максимальную скорость этой реакции.(ответ)

7-3. Начальная скорость окисления сукцината натрия в фумарат натрия под действием фермента сукциноксидазы была измерена для ряда концентраций субстрата:

Определите константу Михаэлиса данной реакции.(ответ)

7-4. Начальная скорость выделения O₂ при действии фермента на субстрат была измерена для ряда концентраций субстрата:

Определите константу Михаэлиса данной реакции.(ответ)

7-5. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость каталитического разложения гидроперекиси тетралина по следующим кинетическим данным:

(ответ)

7-6. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость каталитического окисления циклогексена трет-бутилпероксидом по следующим кинетическим данным:

(ответ)

7-7. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость гидролиза карбобензилоксиглицилфенилаланина под действием карбоксипептидазы по следующим кинетическим данным:

(ответ)

7-8. Рассчитайте концентрацию неконкурентного ингибитора I (K_I = 2.9^.10^-4 моль/л), необходимую для 90%-ного подавления ферментативной реакции.(ответ)

7-9. В некоторых случаях кинетические исследования ферментативных реакций проводят в условиях избытка фермента. Выведите уравнение Михаэлиса-Ментен, описывающее зависимость начальной скорости ферментативной реакции от начальных концентраций фермента и субстрата в системе

при условии, что концентрация фермента намного больше концентрации субстрата.(ответ)

*7-10. Рассмотрите механизм ферментативного катализа с двумя промежуточными комплексами:

Используя метод квазистационарных концентраций и уравнение материального баланса, покажите, что скорость реакции описывается уравнением типа Михаэлиса-Ментен (7.2). Найдите выражения для эффективной максимальной скорости и эффективной константы Михаэлиса через константы скорости отдельных стадий.(ответ)

7-11. Запишите уравнения конкурентного и неконкурентного ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка. Представьте эти уравнения в графическом виде для трех разных начальных концентраций ингибитора (включая [I]₀ = 0). Объясните, как можно определить константу ингибирования.(ответ)

7-12. Запишите уравнения конкурентного и неконкурентного ингибирования в координатах w₀ w₀/[S]₀. Представьте эти уравнения в графическом виде для трех разных начальных концентраций ингибитора (включая [I]₀ = 0). Объясните, как можно определить константу ингибирования.(ответ)

*7-13. Рассмотрите схему неконкурентного ингибирования с разными константами диссоциации комлпексов:

Используя квазистационарное приближение для ES и квазиравновесное приближение для EI и ESI, найдите начальную скорость реакции. Как связаны максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса с соответствующими величинами для неингибируемой реакции?(ответ)