Задача 36. Ферментативная кинетика каталазы

Катализ – одно из центральных понятий в химии и биологии, особенно в биологических и промышленных процессах. Ферменты – это катализаторы биологических процессов. В данной задаче исследуется кинетика разложения перекиси водорода (2H₂O₂® 2H₂O + O₂) каталазой картофеля. Анализ основан на кинетическом уравнении Михаэлиса-Ментен. Каталаза известна как фермент, очень сильно ускоряющий реакцию. Одна молекула каталазы может расщепить до 40 миллионов молекул перекиси в секунду. Такая высокая скорость реакции необходима для удаления активного кислорода, чтобы предохранить компоненты клеток от окислительного действия. Ниже изображена трехмерная структура каталазы E. сoli, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа.

Количество образовавшегося кислорода может быть определено измерением объема или давления в закрытом сосуде. Скорость реакции – это количество кислорода, выделенное в единицу времени.

            Фермент (E) соединяется с субстратом (S), образуя фермент-субстратный комплекс (ES) с константой скорости k₁. ES может разложиться обратно на E и S с константой k₂ или образовать продукт (P) с константой k₃. Применяя метод квазистационарных концентраций, получим:

            d[ES] / dt= k₁([E]_tot – [ES])[S] ,      где [E]_tot= [E] + [ES]

            –d[ES] / dt = k₂[ES] + k₃[ES]

            [S]([E]_tot – [ES]) / [ES] = (k₂ + k₃)/k₁

Величину (k₂ + k₃)/k₁ называют константой Михаэлиса K_M.

            [ES] = [E][S] / (K_M +[S]).

            v = k₃[ES] – скорость реакции

Если весь фермент переходит в ES, то v будет иметь максимальное значение v_max = k₃[E]_tot. Из этих уравнений получаем уравнение Михаэлиса-Ментен:

            v = v_max[S] / (K_M + [S])

Очевидно, K_M  это значение [S], при котором v = v_max/2. Уравнение Михаэлиса-Ментен имеет линейную форму в двойных обратных координатах (см. рис.):

            1/v = (K_M / v_max) (1/[S]) + 1/v_max

Реагенты

Перекись водорода, свежий картофель, каталаза известной концентрации.

Оборудование

миксер, ледяная баня, водяная баня

Методика

1. Приготовьте 0.5, 1, 2, 3, 4, 6% растворы перекиси водорода, разбавив 30% раствор деионизированной водой.

2. Сделайте картофельную выжимку, перемешивая мелко нарезанные куски картофеля с равной массой воды, отделите жидкую фазу. Охладите на ледяной бане.

3. Добавьте 2 мл выжимки к 30 мл разбавленного раствора перекиси водорода и перемешайте. Для проверки используйте 30 мл деионизированной воды.

4. Измерьте объем выделенного кислорода, с помощью установки, нарисованной выше. Определите время, за которое выделяется фиксированный объем (например, 20 мл) газа по поднятию мыльной пленки.

5. Повторите опыт для 6% перекиси, предварительно прокипятив выжимку в течение 10 минут для денатурации фермента.

6. В том случае если доступна чистая каталаза известной концентрации (например, 1 мкМ), повторите для нее все эксперименты.

Вопросы

36-1. Рассчитайте молярную концентрацию перекиси водорода, [S].

36-2. Рассчитайте число молей кислорода, выделявшееся в каждом случае.

36-3. Рассчитайте v для каждого [S].

36-4. Постройте график зависимости v от [S] и проверьте, достигается ли максимальная скорость.

36-5. Постройте график в двойных обратных координатах, определите K_M и v_max.

36-6. Если известна [E]_tot, рассчитайте k₃. Сколько молекул перекиси разлагает одна молекула каталазы в секунду?