ChemNet
 
ВОЗБУДИМЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ.
МОДИФИЦИРОВАННАЯ ОДНОЦЕНТРОВАЯ МОДЕЛЬ
МЕМБРАННОГО РЕЦЕПТОРА
А.П. Полтораков
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
  Возбудимые биологические мембраны играют основную роль в процессах передачи и обработки информации в живом организме. Исследование структуры возбудимых биологических мембран нервных и мышечных клеток необходимо для понимания молекулярных механизмов целого ряда физиологических явлений и процессов: передачи нервного импульса, сокращения мышц, действия на биосистемы различных физиологически активных соединений [1–14]. В основе всех этих явлений лежат механизмы ионной проницаемости мембран, структурно обеспечиваемые ионными каналами и регуляторами прохождения ионов через каналы – мембранными рецепторами [13,14]. Рецепторы, встроенные в структуру каналов, способны либо их открывать либо закрывать, что приводит к изменению проницаемости мембран для соответствующих ионов, возникновению ионных токов и прохождению импульса возбуждения [12,15]. Поэтому исследование структуры рецепторов как составной части мембран необходимо для понимания механизма воздействия различных биологически активных соединений на возбудимые мембраны и их роли в процессах передачи или, наоборот, торможения возбуждения мембран.

Взаимодействие мембранных рецепторов только с определенными биохимическими соединениями – медиаторами (ацетилхолин, адреналин и др.) обеспечивает возникновение процесса возбуждения в ответ на строго специфические физиологические стимулы, что и определяет передачу в организме строго биологической информации. Исследование этих процессов позволяет выяснить механизмы взаимодействия физиологически активных соединений с биомембранами, а также расшифровать тонкую молекулярную структуру рецепторов как одних из основных компонентов клеточных мембран.

Для качественного и количественного описания взаимодействия физиологически активных соединений с рецепторами мембран широко используется теория рецепторов [3–9,12,14]. Согласно этой концепции, биологический эффект, вызываемый в биосистеме каким-либо воздействием, например, физиологически активным соединением, является следствием сложной цепи процессов, где основное звено представлено химическими превращениями специфического структурного элемента системы – рецептора. Теория рецепторов позволяет проводить количественный анализ регистрируемых при этом кривых “доза-эффект”, отражающих зависимость биологического ответа системы от концентрации (дозы) действующего соединения.

Первая количественная модель рецепторной теории была создана Кларком для описания зависимости амплитуды сокращения мышцы от концентрации добавленного в систему медиатора возбуждения – ацетилхолина [1]. В ее основе лежит обратимая химическая реакция между медиатором возбуждения или в общем случае агонистом (A) и рецептором (R) мышечной мембраны, сопровождающаяся образованием комплекса агонист-рецептор (AR):

     KA
A + R  AR

где KA – константа равновесия реакции комплексообразования.

Кларк впервые предположил, что амплитуда мышечного сокращения y пропорциональна концентрации комплекса агонист-рецептор AR [1]. Для произвольного эффекта y постулат Кларка записывается в виде [7,8]:

     при ,                     (1)

где a – коэффициент пропорциональности (коэффициент механохимического сопряжения в случае мышечного сокращения); ymax – максимально возможная амплитуда мышечного сокращения, при которой заняты (оккупированы) все рецепторы; [R0] – общая концентрация рецепторов.

Для условий равновесия уравнение Кларка, описывающее явление полного агонизма, имеет вид:

.                                                             (2)

Полученная зависимость отражает общие закономерности экспериментальных кривых “доза-эффект” для полных агонистов: постепенное нарастание эффекта от нуля до его предельного (максимального) значения с увеличением концентрации агониста. Уравнение Кларка лежит в основе одноцентровой модели рецептора, т.к. при его выводе предполагается взаимодействие с рецептором, имеющим единственный активный центр. Одноцентровая модель позволяет анализировать и более сложные случаи: суммарное действие двух агонистов, конкурентного антагонизма двух соединений и др. [3].

Стефенсон [2] первым обратил внимание на количественное несоответствие уравнения Кларка (2) экспериментальным кривым “доза-эффект”. Можно привести уравнения теории рецепторов в соответствие с экспериментальными кривыми “доза-эффект”, если применять для описания взаимодействия физиологически активного вещества с рецептором более общие (чем постулат Кларка в его простейшем виде) уравнения связи, устанавливающие зависимость между биологическим эффектом и концентрацией комплекса агонист-рецептор.

В настоящей работе на основе общих уравнений связи модифицирована одноцентровая модель рецептора и найдены уравнения, наилучшим образом описывающие явления полного агонизма.
 

ОДНОЦЕНТРОВАЯ МОДЕЛЬ
 
  KA
                                            A + R  R                                                (3)

В основе одноцентровой модели лежит представление о рецепторе (R) как структуре с одним активным центром, взаимодействие с которым соединения-агониста A приводит к образованию комплекса AR и, как следствие, биологическому ответу (y) – мышечному сокращению, что описывается реакцией (3) с константой равновесия KA. Решая кинетическое уравнение этой реакции и используя постулат Кларка, можно получить кривую “доза-эффект” для агониста в относительных координатах в виде зависимости y/ymax от [A]:

.                                                                                       (4)

Ее удобно анализировать в обратных координатах ymax/y от 1/ [A]:

,                                                                                       (4a)

где зависимость (4a) представляет прямую линию, отсекающую на оси ординат отрезок a, равный 1 (пунктирная прямая 2 на рис. 1B).

Сравнение с опытными данными показывает, что экспериментальные кривые описываются несколько иными зависимостями (рис. 1A,C):

,    (5,6)

где a = 0,689, b = 7,97·10–8 моль/л, [A0] = 1,18·10–8 моль/л, [A]max = 2,68·10–7 моль/л. Здесь a – отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат (обратные координаты); b – тангенс угла наклона этой прямой; [A0] – пороговая концентрация агониста, при превышении которой возникает эффект: y і 0 при [A] і [A0]; [A]max – концентрация агониста, по достижении которой эффект становится максимальным: y = ymax при [A] = [A]max  (рис. 1А). Кривые “доза-эффект” получены на 100 изолированных гладкомышечных препаратах подвздошной кишки морской свинки, сокращающихся под действием ацетилхолина [18]. Параметры экспериментальной кривой a, b, [A0] найдены методом наименьших квадратов [17] с использованием компьютерных вычислений и программ “Mathcad 8.”

Таким образом, коэффициент a экспериментальной зависимости (5,6) меньше 1, что не соответствует уравнению Кларка (2). Кроме того, спрямление происходит в координатах 1/([A] – [A0]) (рис. 1C), и в уравнениях появляются новые параметры – пороговая и максимальная концентрации агониста, последняя – в неявном виде.

Наличие пороговой и максимальной концентраций агониста указывает на то, что уравнение связи в виде простейшего постулата Кларка (1) отражает не все особенности действия агонистов. Нами показано, что постулат Кларка является частным случаем более общих уравнений связи, учитывающих пороговые явления и наличие резерва рецепторов [10,11]:

    при ,  (7)

где [AR]min– минимальная (пороговая) концентрация рецепторов или их комплексов с агонистом, начиная с которой возникает эффект; = [AR]min/[R0] – относительная минимальная (пороговая) концентрация рецепторов; [AR]max – концентрация рецепторов, при достижении которой эффект становится максимальным ([AR]max Ј [R0]); = [AR]max/[R0] – относительная максимальная концентрация рецепторов;  – разность между относительными максимальной и минимальной концентрациями рецепторов; a – коэффициент пропорциональности, являющийся для модели мышечного сокращения коэффициентом механо-химического сопряжения.

Графически уравнения связи показаны на рис. 2. Они предусматривают существование пороговых концентраций рецепторов [AR]min и, как следствие, пороговых концентраций агониста [A0]. Биологический смысл наличия пороговых эффектов – отсекать “шумы”, обеспечивая инерционность биосистемы и ее устойчивость к сверхмалым воздействиям.

Другой особенностью уравнений связи является наличие максимальной концентрации рецепторов – [AR]max, меньшей либо равной их общей концентрации. За счет этого формируется резерв рецепторов – rr, равный разности концентраций [R0] и [AR]max  (рис. 2):

[rr] = [R0] – [AR]max                                                                                      (8)

или относительный резерв рецепторов :

= [rr]/ [R0] = 1 – .                                                                            (9)

При оккупации агонистом резерва рецепторов эффект не меняется и остается максимальным. Впервые идею о наличии резерва рецепторов высказал Стефенсон [2]. Доказательством его существования являются опыты по необратимому выключению рецепторов с помощью соединений, образующих с ними ковалентные связи: при блокировании рецепторов из резерва способность мышцы к максимальному ответу сохраняется [3,25]. Как пример можно привести эксперименты по выявлению резерва опиатных рецепторов подвздошной кишки морской свинки с помощью алкилирующего соединения b -хлорналтрексамина [26], резерва М-холинорецепторов продольной мышцы тонкой кишки морской свинки с помощью необратимого блокатора бензилилхолиниприта [6].

Область резерва рецепторов (rr) на рис. 2А заштрихована. Биологический смысл резерва рецепторов – повышение надежности функционирования биосистемы. В модели Кларка резерв рецепторов отсутствует, и максимальный эффект достигается оккупацией агонистом всех рецепторов: [rr] = 0 и [AR]max = [R0]. В этой модели отсутствуют и пороговые эффекты: = 0 и [A0] = 0. Поэтому постулат Кларка (1) является частным случаем общих уравнений связи, что изображено на рис. 2А пунктиром 4. Здесь же представлены другие частные случаи: постулат Кларка, учитывающий пороговые эффекты (кривая 2), и полностью пороговые зависимости, соответствующие условию [AR]min = [AR]max и закону “все или ничего” (кривая 3).

Применяя общее уравнение связи (7), выведем зависимость “доза-эффект” при наличии резерва рецепторов и пороговой (минимальной) концентрации комплексов. Для этого используем уравнение для равновесной концентрации комплекса агонист-рецептор:

[AR] = KA [A] [R],                                                                                  (10)

где [R] – концентрация свободных рецепторов; уравнение материального баланса для общей концентрации рецепторов:

[R0] = [R] + [AR],                                                                                   (11)

уравнения для концентраций агониста [A] и [A0], вытекающие из (8–11):

 .               (12,13)

Последние два уравнения позволяют вычислить разность [A] – [A0] и с помощью уравнения связи (7) y = a ([AR] – [AR]min) получить зависимость эффекта от разности концентраций агониста:

.                              (14)

Найденное уравнение можно выразить в относительных координатах, учитывая из (7) связь максимального эффекта с общей концентрацией рецепторов :

,                                              (15)

где .

В обратных координатах:

.                                                 (16)

Таким образом, получены теоретические уравнения одноцентровой модели, соответствующие экспериментальной зависимости (5,6) для полных агонистов со следующими значениями параметров:

;     (17)

.

Из найденных уравнений следует, что вид кривых “доза-эффект” определяется параметрами уравнений связи и реакции взаимодействия агониста с рецептором. Из них основными являются относительный резерв рецепторов и константа равновесия KA. Поэтому анализ уравнений (15–17) проведем с помощью варьирования этих двух параметров, значение которых можно определить из экспериментальных кривых (5,6). Вначале рассмотрим влияние величины – кривые (1–4) на рис. 3А,B.

Кривая (1): = 0.1, = 0.721, = 0.279, KA = 9.6·106 л/моль. Эти величины рассчитаны по формулам, полученным из (17):

;                           (18)

,

где значения a, b, [A0] взяты из экспериментальной зависимости (5,6).

При анализе кривой (1) необходимо отметить очень хорошее соответствие теоретической зависимости (15) опытным данным: в обратных координатах экспериментальные точки точно ложатся на прямую, отсекающую на оси ординат отрезок a = 1 – (/1– ), меньший единицы (рис. 1C). Поэтому прямая по отношению к единице смещена вниз по оси ординат, причем смещение определяется в основном величиной резерва рецепторов: чем он больше, тем смещение больше. Таким образом, основная причина отклонения кривых от уравнения Кларка – наличие резерва рецепторов, составляющего 28% от их общего количества. Большое значение в гладких мышцах связано с их тоничностью – способностью поддерживать постоянный мышечный тонус достаточно продолжительное время, что достигается функционированием мышцы в области резерва рецепторов, где сокращение максимально.

Рассмотрим поведение кривой (1) при больших концентраций агониста: при = 2,68·10–7 моль/л эффект принимает максимальное значение, т.к. оккупируется количество рецепторов [AR]max, необходимое для получения максимального эффекта. После этого начинается область резерва рецепторов , и увеличения эффекта не происходит.

Еще один параметр кривой – пороговая концентрация агониста [A0], определяемая минимальной концентрацией рецепторов = 0,1. Это означает, что для получения минимального эффекта необходимо активировать свыше 10% рецепторов. Наличие пороговой концентрации приводит к тому, что кривая (1) выходит не из начала координат, а из точки [A0] = 1,2·10–8 моль/л.

Кривая (2). Получена с уменьшенным в два раза резервом рецепторов: = 0,14, = 0,86 и не изменившейся [A0]. В результате происходит увеличение максимальной концентрации агониста до значения = 6,4·10–7 моль/л, и кривая “доза-эффект” сдвигается вправо по оси абсцисс, т.к. требуется большее количество агониста для достижения максимальной концентрации занятых рецепторов (уравнение 17). Уменьшенный в два раза резерв рецепторов показан на графике заштрихованной областью . В обратных координатах прямая (2) в связи с уменьшением резерва рецепторов поднимается вверх по оси ординат.

Кривая (3): = 0, = 1. Резерв рецепторов отсутствует, максимальная концентрация по уравнению (17) принимает бесконечно большое значение – , и максимальный эффект достижим только в пределе: y —> ymax и y/ymax —> 1. В обратных координатах прямая еще выше поднимается вверх по оси ординат и стремится к точке a = 1, что на графике рис. 3B обозначено стрелкой. Уравнение этой прямой соответствует уравнению Кларка, учитывающему пороговый эффект:

.                                                      (19)

Кривая (4): = 0 и = 0. Отсутствуют резерв и пороговая концентрация рецепторов. Кривая полностью соответствует уравнению Кларка (2), выходит из начала координат и спрямляется только в обратных координатах ymax/y от 1/[A].

Исходя из полученных значений, и можно реконструировать уравнение связи в относительных координатах [AR]/[R0] – рис. 2B. На графике показаны прямые 1–3, соответствующие последовательному уменьшению резерва рецепторов до нуля, и пунктирная прямая 4, выходящая из начала координат и построенная по постулату Кларка.

Уравнение одноцентровой модели позволяет проследить поведение кривых “доза-эффект” при варьировании кинетического параметра – константы равновесия KA и постоянных , и . В прямых координатах при уменьшении KA происходит параллельный сдвиг кривых “доза-эффект” в сторону больших концентраций – рис. 4А. При этом по уравнению (17) увеличиваются и пороговые, и максимальные концентрации агониста, что связано с уменьшением его сродства к рецептору. В координатах ymax/y от 1/[A] кривые ”доза-эффект” с разными значениями KA представляют семейство прямых линий с изменяющимся углом наклона, выходящих из точки a = 1 – /(1–) – рис. 4B,C. В координатах ymax/y от 1/([A] – [A0]) объединить эти кривые нельзя, т.к. [A0] зависит от константы равновесия. Прямолинейный характер зависимости сохраняется для больших концентраций агониста, когда [A] >> [A0] и . При малых значениях [A] прямые искривляются из-за влияния пороговой концентрации [A0] – рис. 1B.

Как пример параллельного сдвига кривых “доза-эффект” вдоль оси концентраций при изменении константы равновесия приведены результаты экспериментов Ариенса, выполненных на отрезках тощего кишечника крысы [4]. Исследована серия агонистов от тетраметиламмония до ацетилхолина, для которой наблюдался подобный эффект (рис. 5A). Параметры теоретических кривых рассчитаны по формулам (18) и приведены в таблице. Из нее следует, что по мере редуцирования молекулы ацетилхолина до иона тетраметиламмония происходит последовательное уменьшение (приблизительно на три порядка) константы сродства к активному центру рецептора. При этом параметры уравнений связи и остаются практически одинаковыми, т.к. эксперименты проводились на одном и том же объекте. Это позволяет построить в логарифмических координатах линейные зависимости пороговой и максимальной концентраций агониста от KA (уравнения 17):

.                         (20)

Графики уравнений (20) представляют собой параллельные друг другу прямые с тангенсом угла наклона, равным минус единице – рис. 5B. Эти прямые отражают параллельный сдвиг кривых “доза-эффект” при изменении константы сродства агониста к рецептору.

Уменьшение KA в данном ряду соединений обусловлено структурой М-холинорецептора, имеющего в активном центре как минимум два участка: анионный и эстератический [5,14,16]. С первым взаимодействует положительно заряженный четвертичный азот молекулы агониста, со вторым – карбонильный и эфирный атомы кислорода. Взаимодействие с этими участками молекулы физиологического агониста – ацетилхолина обеспечивает его специфичность и высокое сродство к холинорецептору. Поэтому последовательное уменьшение KA при редуцировании молекулы ацетилхолина до тетраметиламмония связывается с постепенным уменьшением его взаимодействия с эстератическим участком активного центра холинорецептора. Ионы тетраметиламмония способны взаимодействовать только с анионным участком активного центра и имеют поэтому самое низкое значение константы сродства.

Аналогичным образом ведет себя и другой важный концентрационный параметр кривых “доза-эффект” – 50%-ная эффективная концентрация агониста:

.                                     (21)

[A]50 также определяется при постоянных , и величиной константы равновесия KA. В логарифмических координатах зависимость (21) является линейной, расположена посередине между прямыми для [A0] и [A]max (рис. 5B) и имеет важное практическое значение. С ее помощью можно определять величину константы равновесия:

.                                      (21а)

Многие исследователи [3,12,16], определяют константу равновесия из уравнения Кларка (2), согласно которому KA= 1/[A]50. Последнее равенство справедливо лишь при отсутствии резерва рецепторов (= 0 ) и беспороговых кривых “доза-эффект” ( = 0), что практически не осуществляется. Отличие от истинной величины KA может достигать значительных величин. Так, при экспериментальном значении [A]50= 4,4·10–7 моль/л  KA= 1/[A]50 = 2,2·106 л/моль, что более чем в четыре раза меньше истинного значения константы равновесия, рассчитанного по уравнению (21а) – 9,6·106 л/моль. Следовательно, наличие резерва рецепторов и пороговых свойств необходимо учитывать при определении KA.
 

Пороговая модель или закон “все или ничего”

Пороговая модель получается при равенстве пороговой и максимальной концентраций рецептора, из которого следуют три других:
 

[AR]min = [AR]max ——>                                             (22)

Применяя к (22) уравнения связи (7), получаем уравнения пороговой модели:

    при ,

    при ,                                   (23)

.

Из графика уравнения (23) следует, что по достижении пороговой концентрации агониста эффект сразу возрастает до максимального значения (рис. 6B). В точках [AR]min = [AR]max и [A0] = [A]max функция разрывна. В относительных координатах она приобретает всего лишь два значения: 0 или 1 (рис. 6A).

В физиологии пороговые закономерности известны как закон “все или ничего”. Ему подчиняются спонтанные сокращения сердечной мышцы, для анализа которых нами применялось уравнение (23) [7]. Особое значение этот закон имеет при функционировании нервной системы: передачи нервного импульса между нейронами, осуществляемое с помощью нейротрансмиттеров (в частности, ацетилхолина), взаимодействующих с рецепторами постсинаптических мембран. Функционирование нейронов в режиме “все или ничего (0 – 1) обеспечивает работу нейронных сетей [19,20]. Режим, близкий к пороговому, найден нами при моделировании процессов клеточного деления и действия некоторых цитостатиков [11].

Таким образом, параметры уравнений связи: максимальная и минимальная концентрации рецепторов, а также резерв рецепторов, определяют общий характер кривых “доза-эффект” для агонистов и их частные случаи, что можно обобщить в следующем виде.

1.Общий случай (уравнения 15,16):

;   0 Ј Ј 1 ;   0 Ј Ј 1 ;   0 Ј Ј 1 .

2. Постулат Кларка:

= 0; = 1; = 0.

3. Пороговая модель (закон “все или ничего”):

.

Литература
  1. Clark A.J. The reaction between acetylcholine and atropine // J. Physiol. (London). 1926. Vol. 61. P. 530–546.
  2. Stephenson R.P. A modification of receptor theory // Br. J. Pharmacol. 1956. Vol. 11. P. 379–393.
  3. Ariense E.J. (Ed.). Molecular pharmacology: the mode of action of biologically active compounds. Vol. 1, N.Y.–L., 1964. 503 p.
  4. Ariense E.J. Intrinsic activity: partial agonists and partial antagonists // J. Cardiov. Pharmacol. 1983. Vol. 5. Suppl. № 1. P. 8–15.
  5. Михельсон М.Я., Зеймаль Э.В. Ацетилхолин. О молекулярном механизме действия. Л.: Наука, 1970. 279с.
  6. Зеймаль Э.В., Шелковников С.А. Мускариновые холинорецепторы. Л.: Наука, 1989. 288с.
  7. Полтораков А.П., Бут П.Г., Пирузян Л.А., Чибрикин В.М., Вихляев Ю.И. и Ульянова О.В. Кинетика процессов взаимодействия производных фенотиазина с биорецепторами // Изв. АН СССР. Сер.хим. 1973. № 9, с. 2099–2105.
  8. Полтораков А.П., Чибрикин В.М., Пирузян Л.А. Кинетические модели одиночного мышечного сокращения // Биофизика. 1978. Т. 23. № 1, с. 105–109.
  9. Полтораков А.П., Чибрикин В.М. Кинетические модели тетанических сокращений мышцы // Биофизика. 1982. Т. 27. № 1, с. 341.
  10. Полтораков А.П. Математическая модель для описания кривых выживания организмов // Ж. общ. биол. 1996. Т. 57. № 2, с.149–164.
  11. Полтораков А.П., Коваленко О.А., Тарасова Н.И. Количественное описание цитостатических эффектов хелаторов ионов переходных металлов (на примере пиколиновой кислоты и Fe2+) // Изв. РАН. Сер. биол. № 6, с.645–652.
  12. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы физиологически активных веществ. М.: Медицина, 1987. 400с.
  13. Скок В.И., Селянко А.А., Деркач В.А. Нейрональные холинорецепторы. М.: Наука, 1987. 343с.
  14. Говырин В.А., Жоров Б.С. Лиганд-рецепторные взаимодействия в молекулярной физиологии. Спб.: Наука, 1994. 240с.
  15. Данилов А.Ф. Постсинаптические миорелаксанты. Спб.: Наука, 1994. 156с.
  16. Комиссаров И.В. Элементы теории рецепторов в молекулярной фармакологии. М.: Медицина. 1969. 216с.
  17. Вентцель Е.С. Теория вероятностей. М.: Наука, 1964. 576с.
  18. Блаттнер Р., Классен Х., Денерт Х., Деринг Х. Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц. М.: Мир., 1983. 200с.
  19. Черныш В.И., Напалков А.В. Математический аппарат биологической кибернетики. М.: Медицина, 1964. 374с.
  20. Еськов В.М. Введение в компартменную теорию респираторных нейронных сетей. М.: Наука, 1994. 167с.
  21. Gill E.W., Rang H.P. An alkylating derivative of benzylilcholine with specific and long-lasting parasympatholytic activity // Molec. Pharmacol. 1966. Vol. 2, N 4. P. 284–297.
  22. Chavkin C., Goldstein A. Reduction in opiate receptor reserve in morphine tolerant guinea pig ilea // Life Sci., 1982. Vol. 32, N 16–17. P. 1687–1690.
  23. Schulman J.M., Sabio M.L. and Disch R.L. Recognation of cholinergic agonists by muscarinic receptors. 1. Acetylcholine and other agonists with NCCOCC backbone // J. Med. Chem. 1983. Vol. 26. N 6. P. 817–823.
Copyright ©



Сервер создается при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
Не разрешается  копирование материалов и размещение на других Web-сайтах
Вебдизайн: Copyright (C) И. Миняйлова и В. Миняйлов
Copyright (C) Химический факультет МГУ
Написать письмо редактору