АпоЕ выделяли из изолированных частиц ЛОНП согласно [9]. Восстановление S–S связей и блокирование SH–групп апоЕ йодацетамидом (алкилирование) проводили, как описано [10]. Мечение алкилированного апоЕ (5,6 мкМ) дансил-хлоридом (Serva, ФРГ) или флуоресцеинизотиоционатом (Isomer I, Sigma, США) проводили в 0,1 М NаНСО₃, рН 9,2 при мольном отношении краска/белок 10:1. Для получения разной стехиометрии мечения инкубацию проводили в течение разного времени, но не более 14 часов. Непрореагированную метку отделяли гель-фильтрацией на РD-10 колонке (Pharmacia/LKB, Швеция), уравновешенной 0,02 М трис-НСl, рН 7,5, 0,15 М NаСl, 0,1 mM ЕDTA (буфер А), и последующим диализом против 100-кратного избытка буфера А. Образцы фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (HV-тип, Millipore, США) и концентрацию белка во флуоресцентно-меченных препаратах определяли по [11] с использованием алкилированного апоЕ в качестве стандарта. Для нахождения концентрации последнего использовали вычисленный нами из аминокислотного состава апоЕ коэффициент молярной экстинкции при 280 нм e₂₈₀ =43376 М^–1см^–1. Стехиометрию мечения рассчитывали, принимая во внимание e₃₄₀ =3400 М^–1см^–1для связанного дансила [12] и e₄₉₅ =42500 М^–1см^–1 для связанного флуоресцеина [13].

Образцы для флуоресцентных измерений готовили в буфере А тремя различными способами. Во-первых, растворы дансил-меченного апоЕ (апоЕ/Д) и флуоресцеин-меченного апоЕ (апоЕ/Ф) в разных соотношениях донор:акцептор смешивали в объеме 500 мкл (донор-акцепторная пара, образец ДФ) и инкубировали в течение двух часов при 24°С. Готовили также три остальных образца, содержащих только апоЕ/Д (только донор, Д-образец), только апоЕ/Ф (только акцептор, Ф-образец), или только немеченный апоЕ (контрольный образец). Во всех образцах общую концентрацию апоЕ сохраняли постоянной и равной 0,6–0,8 мкМ. Во-вторых, четыре различных препарата (см. выше) предварительно денатурировали 4 М Gdn–HCl в течение трех часов при 24°С и затем диализовали при 4°С в мешочках для диализа (Serva, ФРГ, предел пропускания 12–14 кДа) с двумя сменами против 500-кратного избытка буфера А. Третий способ заключался в солюбилизации четырех образцов в объеме 200 мкл холатом Nа в концентрации 7,5 мМ, что выше критической концентрации мицеллообразования, в течение двух часов при 24°С и последующей инкубации в течение ночи при 4°С. Непосредственно перед диализом препарат разбавляли до 500 мкл буфером А и диализ проводили в микродиализаторе (Microdialyzer System 500, Pierce, США) с диализной мембраной Spectra/Рor 4 (предел пропускания 12–14 кДа) при 24°С в течение 48 часов с тремя сменами. Диализат представлял собой буфер А с 0,1 мМ ФМСФ и с 0,5 г адсорбента желчных кислот ХАD-2 (Sigma, США). 100 мл диализата в диализной камере посредством перистальтического насоса постоянно перемешивались с дополнительными 200 мл раствора в стакане, содержимое которого также перемешивалось с помощью магнитной мешалки.

Для изучения кинетики процесса ренатурации апоЕ образцы готовили аналогичным образом, за исключением того, что дансил- и флуоресцеин-меченный апоЕ смешивали в мольном отношении 1:1, и апобелок денатурировали или 4 М Gdn–HCl или холатом Na в концентрации 60 мМ. Для неалкилированных образцов добавляли ДТТ до 10 мМ. После гуанидин- или холат-индуцированной денатурации образцы диализовали при 4°С в течение 48 часов с двумя сменами в диализных мешочках против 500-кратного избытка буфера А с 0,1 мМ ФМСФ и с 0,2 г/л XAD-2. В случае неалкилированных образцов в буфер добавляли ДТТ до 1 мМ. После диализа один набор проб инкубировали при 0°С, другой – при 24°С и измеряли различные флуоресцентные параметры при 24°С через различные промежутки времени после снятия препаратов с диализа. Для измерений в конкретной временной точке каждый раз бралась свежая аликвота раствора меченого апобелка для исключения фотодеструкции.

Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметрах RF-540 (Shimadzu, Япония) или Aminco-500 (Aminco, США) при 24°С. Ширина щели на возбуждении была 2 нм, на эмиссии – 4 нм (Aminco-500) или по 5 нм (RF-540). Из спектров флуоресцентно-меченных образцов вычитали сигнал из контрольного образца.

Эффективность переноса энергии E (в %) по сенсибилизации флуоресценции акцептора рассчитывали по формуле:

,

где в скобках приведено обозначение образца, I и A – интенсивности флуоресценции и поглощения, нижние и верхние цифры – длины волн возбуждения и эмиссии, соответственно. Смысл заключается в вычитании из сигнала донор-акцепторной пары в области, обогащенной флуоресценцией акцептора при возбуждении в полосе возбуждения донора, вкладов сигналов донора и акцептора, непосредственно возбуждаемых при этой длине волны. Аналогичный прием расчета был использован Borochov-Neori с соавт. [14].

Величину анизотропии флуоресценции r для флуоресцеин-меченного образца измеряли с учетом G-фактора, корректирующего поляризацию в монохроматоре эмиссии [15]. Все результаты измерений корректировали с учетом светорассеяния. Длины волн возбуждения и регистрации флуоресценции составляли, соответственно, 490 и 520 нм. Для тушения флуоресценции апоЕ/Ф анионами I^– долю доступных флуорофоров f и константу тушения Штерн-Фольмера К_Ш-Ф определяли при экстраполяции модифицированной зависимости Штерн-Фольмера [15]:

,

где I_o и I – интенсивность флуоресценции в отсутствии и в присутствии тушителя, на область бесконечно больших концентраций анионов I^–.

“Сшивание” апоЕ в концентрации 0,72 мкМ проводили в буфере Б водорастворимым бифункциональным реагентом ЭДК в концентрации 20 мМ при 24°С. В разные промежутки времени отбирали аликвоты и реакцию останавливали добавлением буфера для образцов для электрофореза в системе с ДДС–Na [16]. После разделения продуктов реакции электрофорезом в ПААГ в градиенте концентраций акриламида 5–20% в системе с ДДС–Na гель окрашивали серебром [17].

[На следующую главу] [На оглавление] [На список сокращений и обозначений]