Нобелевская премия по химии 2003

Мембранные каналы

Пресс-релиз Нобелевского комитета

Введение

      Живые клетки окружены липидными двухслойными мембранами, которые отделяют их от других клеток и внеклеточного пространства. В клетках мембранами также окружены органеллы, такие как ядро, митохондрии и хлоропласты.

      Липидные двухслойные мембраны в обычном состоянии непроницаемы для воды, ионов и других полярных молекул, до тех пор пока они не должны быть быстро и селективно транспортированы через мембрану, часто в ответ на вне- или внутриклеточный сигнал. Транспорт в направлении градиента концентрации осуществляется с помощью посредников - мембранных белков (каналов), в то время как транспорт в направлении, обратном градиенту концентрации, осуществляется при участии мембранных <насосов>, например, Na⁺/K⁺ - ATPазы (белок, открытый в 1957 году Дженсом Скоу (Jens Skou), который получил Нобелевскую премию по химии в 1997 году).

      Водные каналы позволяют клетке регулировать свой объем и внутреннее осмотическое давление и необходимы, когда вода должна быть доставлена из различных жидкостей организма, например, когда моча собирается в почках. В растениях водные каналы играют решающую роль при абсорбции воды в корне и для установления внутреннего водного баланса. Водные каналы абсолютно необходимы для жизни и существуют во всех организмах - от бактерии до человека.

      Ионные каналы позволяют клетке генерировать и передавать электрический сигналы и являются основными молекулярными строительными блоками в нервной системе. Ионные каналы могут открываться или закрываться в ответ на разные сигналы (связывание лигандов, трансмембранное напряжение, температура, механические напряжения), то есть они управляются импульсами. Большинство ионных каналов высоко селективны по отношению к тому или иному иону (Na⁺, K⁺ , Ca²⁺, Cl^- ) и могут обеспечивать очень высокие скорости транспорта (~10 ⁸ ионов в секунду). У человека ионные каналы участвуют в развитии многих болезней внутренних органов, например, мозга, сердца, мышечной системы.

Водные каналы

      О существовании водных каналов было высказано предположение еще в средине 19 века (Брук (Brucke) 1843, Оствальд (Ostwald) 1890, Пфайфер (Pfeffer), 1877). В конце 1950- х было обнаружено, что вода быстро транспортируется через мембрану клетки красных кровяных телец с помощью водно-селективных каналов, не пропускающих ионы (Sidel и  Solomon, 1957). Исследования водного транспорта в различных организмах и органах в последующие 30 лет показали, что водные каналы имеют узкий селективный фильтр, препятствующий проникновению протона (H₃O⁺) и обеспечивающий очень высокую скорость проникновения молекул воды (вплоть до10⁹  молекул в секунду). Но до 1987 года никто не мог идентифицировать белок-канал для воды (Финкельштейн (Finkelstein), 1987)и представление о водно-специфических каналах оставалось весьма туманным.

      Неуловимые водные каналы были, наконец, открыты Питером Агрэ. В середине 1980-х Агре изучал Rh - антигены мембраны клетки. В 1988 году он выделил новый мембранный белок 28 kDa с неизвестной функцией, СHIP28, как из эритроцитов, так и из почечных канальцев. После расшифровки последовательности аминокислот и получения фрагментов кДНК, кодирующей белок СHIP28, он понял, что этот белок ‑ так долго искомый проводник воды (водный канал). Вскоре после этого Агрэ экспериментально доказал свой вывод, продемонстрировав, что экспрессия СHIP28 в Xenopus oocytes (в яйцеклетках лягушки) быстро приводит к набуханию клеток при помещении их в среду с пониженным осмотическим давлением. Тоже явление наблюдалось, когда очищенный СHIP28 вводился в модельную липидную мембрану. В обоих случаях разбухание ингибировалось ионами Hg ²⁺, то есть известным методом блокирования водного транспорта через мембрану клетки эритроцита.

      Открытие СHIP28 (теперь известного как аквапорин 1 или AQP1) был решающим моментом в изучении клеточных водных каналов. С тех пор аквапориноподобные белки были найдены во всех живых организмах, только у человека по крайней мере 11 разных аквапориноподобных белков, многие из которых имеют отношение к различным заболеваниям. Растения имеют еще большее число аквапоринов, например, не менее 35 различных их версий было найдено в модельном растении Arabidopsis thaliana.

      Физиологическая важность аквапоринов наиболее заметна в почках, где 150-200 литров воды ежедневно должны быть ресорбированы из первичной мочи. Это возможно, главным образом, благодаря двум аквапоринам - AQP1 и AQP2. AQP1 экспрессируется в прямых почечных канальцах, в то время как AQP2 экспрессируется в собирающих протоках.

      В 2000 -ом и 2001 -ом годах были опубликованы первые 3D-структуры AQP1 и родственных глицерин-селективных бактериальных протеинов (G1pF). Основываясь на этих структурах, была предложена модель, объясняющая высокую скорость пропускания и высокую селективность водных каналов, а также способность AQP1препятствовать проникновению протонов. Суть модели состоит в том, что архитектура каналов позволяет проходить молекулам воды обособленной единицей (отдельной группой), и положительно заряженные функциональные группыв каналах сдерживают проникновение H₃O⁺ . Более того, локальное электростатическое поле, генерируемое изменением белковой полярности в середине канала, заставляет молекулы воды вращаться таким образом, что их дипольные моменты ориентируются в противоположных направлениях в верней и нижней половинах каналах. Эта переориентация предотвращает формирование непрерывной цепочки водородно-связанных молекул воды через канал и тем самым блокирует прохождение протонов посредством прыжкового механизма (через <протонные прыжки>).

      Всего лишь за десять лет было достигнуто практически полное понимание функции водных каналов на атомном уровне и выяснена физиологическая роль водных каналов в живых организмах и их роль в развитии болезней. Неожиданное открытие аквапоринов Агрэ произвело революцию в изучении транспорта воды и заложило твердый биохимический фундамент в весьма важных областях физиологии и медицины.

Ионные каналы

      Еще в 1890 году Вильгельм Оствальд (Нобелевский лауреат по химии 1909 года), основываясь на экспериментах с искусственно полученными коллоидными мембранами, предположил, что электрические токи в живых материях могут быть вызваны движением ионов через клеточные мембраны. Работа начала 20 века (Бернштейн 1902, Лойб и Бьютнер ( Loeb and Beutner) 1912) позволила установить, что природа мембранных электрических потенциалов электрохимическая, и в 1925 году было сделано предположение о существовании узких ионных каналов (Михаэльс (Michaelis) 1925).

      Работа Ходгкина (Hodgkin) и Хюкслея (Huxley) в начале 1950-х годов по ионному транспорту через мембрану аксона гигантского кальмара (за которую они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1963 году) открыла новую эру в нейрофизиологии и быстро привела к детальной модели действия электрического потенциала в нервной клетке, основанной на идее, что в мембране присутствуют отдельные, регулируемые потенциалом ионные каналы для Na⁺ и K⁺ , ( и иногда Ca ²⁺). Было также показано, что ионы калия перемещаются через мембрану обособленными единицами.Основные принципы быстрого транспорта, ионной селективности, затворных свойств каналов и инактивации каналов были ясно сформулированы уже на этой ранней стадии, но лежащий в их основе молекулярный механизм был совершенно неясен.

      Биохимические исследования, проведенные в ряде лабораторий в 1960-е - 1970 е годы на ацетилхолиновом рецепторе, привели к первой биохимической идентификации белковых ионных каналов. В начале 1970-х с помощью биофизических методов были измерены размеры <селективных фильтров> в нейрональных каналах Na⁺  и K⁺, <открывающихся> и <запирающихся> с помощью потенциала (потенциало-управляемых каналах) и было установлено, что <затворные> и селективные фильтры являются разными структурными элементами. Благодаря методу <одноканальной записи>, разработанному Нэхером (Neher) и Сэкманном (Sakmann) - Нобелевскими лауреатами по физиологии и медицине 1991 года ‑

      было проведено очень детальное исследование проникновения железа. Комбинирование этого метода с клонированием, мутагенезом и экспрессией белковых ионных каналов в клетках, таких как Xenopus oocytes, обеспечило быстрый прогресс в выявлении разных функциональных областей разнообразных ионных каналов.

      К середине 90-х стало ясно, что

      Получить 3D-структуры высокого разрешения для мембранных белков очень трудно, и ионные каналы не исключение.

      Большой прорыв произошел в 1998 году, когда Родерик МакКиннон добился успеха в получении первой структуры высокого разрешения ионного канала KcsAK⁺из Streptmyces lividans. Как было видно, дизайн селективного фильтра совершенно приспособлен для десольватирования ионов калия, не пропуская более маленький ион натрия, что объясняет высокую K⁺ - селективность и высокую скорость транспорта. При более высоком разрешении гидратированный ион калия мог быть даже виден в <захваченном состоянии> с обеих сторон селективного фильтра и стало ясно, что селективный фильтр состоит из непрерывного ряда K⁺-связывающих мест. KcsA структура показывает канал в закрытом состоянии. Структура Ca ²⁺-активируемого бактериального K⁺-канала MthK, опять же, выявленная МакКинноном, фиксирует канал в открытом состоянии. Сравнение KcsA и MthK структур позволяет выявить общий механизм пропускания канала, предполагающий, что изменение состояния в активном центре (регуляторном домене) вытягивает трансмембранные спирали к внутриклеточному выходу канала.

      Некоторые K⁺ - каналы проводят ионы только в одном направлении, выступая в качестве "молекулярных диодов". Такие "выпрямляющие" каналы блокированы Mg²⁺и полиаминами, которые проникают в канал из его цитозольного конца, когда мембрана деполяризована. Первая структура области (домена), ответственной за <выпрямление>, была представлена МакКинноном в 2002 году. Молекулярная основа другого важного процесса инактивации каналов - + - канальных гомологов KcsA.

      Как уже было показано Ходгкином и Хьюкслеем, в возбудимых клетках, таких как нервные, мышечные и эндокринные, регулирование <открытия-закрытия> ионного канала с помощью эл. потенциала является главным принципом активации. Точная структура каналов, не управляемых напряжением до сих пор неизвестна.

      В течение последних нескольких лет были начаты структурные исследования по выяснению молекулярных функций механочувствительных и Cl^--селективных ионных каналов. Параллельно электронно- рентгеноструктурные кристаллографические исследования привели к значительно лучшей структурной модели ацетилхолиновых рецепторов.

      Работы МакКиннонона на K⁺-каналах открыли молекулярную основу ионной селективности, инактивации, затворного механизма и открыли совершенно новые возможности для детальных биохимических, биофизических и теоретических исследований функции ионных каналов. Его исследования также обеспечили твердый фундамент для понимания на молекулярном уровне неврологических, мышечных и сердечных болезней, открыв новые возможности для разработки лекарств.

Завершающие замечания

      Мембранные каналы обеспечивают быстрый, селективный и регулируемый транспорт воды, ионов через биологические мембраны. Они найдены во всех живых клетках и лежат в основе основных клеточных функций, таких как передача нервного импульса, мышечное сокращение, кардио-функции, ресорбция воды в почках, снабжение водой корней растений и отвечают за осмотическое давление в микроорганизмах.

      Быстрый прогресс в нашем понимании функции мембранных каналов за последние десять лет в большой степени обусловлен фундаментальными открытиями, касающимися водных и ионных каналов. Открытие Питером Агрэ аквапориновых водных каналов и детальные структурные и механистические исследования К+-каналов являются выдающимися достижениями, сделавшими возможными увидеть изящно сконструированные молекулярные механизмы в действии на атомном уровне.